食品中脂肪酸含量測定標(biāo)準(zhǔn)（氣相色譜內(nèi)標(biāo)法）
執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB 5009.168-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中脂肪酸含量的測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中總脂肪、飽和脂肪(酸)、不飽和脂肪(酸)的測定。
本標(biāo)準(zhǔn)中水解-提取法適用于食品中脂肪酸含量的測定;酯交換法適用于游離脂肪酸含量不大于
2%的油脂樣品的脂肪酸含量測定;乙酰氯-甲醇法適用于含水量小于5%的乳粉和無水奶油樣品的脂
肪酸含量測定。

法 內(nèi)標(biāo)法
原理
1 水解-提取法:加入內(nèi)標(biāo)物的試樣經(jīng)水解-y醚溶液提取其中的脂肪后,在堿性條件下皂化和甲酯化,生成脂肪酸甲酯,經(jīng)毛細(xì)管柱氣相色譜分析,內(nèi)標(biāo)法定量測定脂肪酸甲酯含量。依據(jù)各種脂肪酸甲酯含量和轉(zhuǎn)換系數(shù)計算出總脂肪、飽和脂肪(酸)、單不飽和脂肪(酸)、多不飽和脂肪(酸)含量。動植物油脂試樣不經(jīng)脂肪提取,加入內(nèi)標(biāo)物后直接進行皂化和脂肪酸甲酯化。
2 酯交換法(適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂):將油脂溶解在異辛烷中,加入內(nèi)標(biāo)物后,加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化,反應(yīng)*后,用硫酸氫鈉中和剩余氫氧化鉀,以避免甲酯皂化。
3 試劑和材料
除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級水。
3.1 試劑
3.1.1 鹽酸(HCl)。
3.1.2 氨水(NH3·H2O)。
3.1.3 焦性沒食子酸(C6H6O3)。
3.1.4 y醚(C4H10O)。
3.1.5 石油醚:沸程30℃~60℃。
3.1.6 乙醇(C2H6O)(95%)。
3.1.7 甲醇(CH3OH):色譜純。
3.1.8 氫氧化鈉(NaOH)。
3.1.9 正庚烷[CH3(CH2)5CH3]:色譜純。
3.1.10 sf化硼甲醇溶液,濃度為15%。
3.1.11 無水硫酸鈉(Na2SO4)。
3.1.12 氯化鈉(NaCl)。
3.2 試劑配制
3.2.1 鹽酸溶液(8.3mol/L):量取250mL鹽酸,用110mL水稀釋,混勻,室溫下可放置2個月。
3.2.2 y醚-石油醚混合液(1+1):取等體積的y醚和石油醚,混勻備用。
3.2.3 氫氧化鈉甲醇溶液(2%):取2g氫氧化鈉溶解在100mL甲醇中,混勻。
3.2.4 飽和氯化鈉溶液:稱取360g氯化鈉溶解于1.0L水中,攪拌溶解,澄清備用。
3.2.5 氫氧化鉀甲醇溶液(2mol/L):將13.1g氫氧化鉀溶于100mL無水甲醇中,可輕微加熱,加入無
水硫酸鈉干燥,過濾,即得澄清溶液。
3.3 標(biāo)準(zhǔn)品
3.3.1 十一碳酸甘油三酯(C36H68O6,CAS號:13552-80-2)。
3.3.2 混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品。
3.3.3 單個脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品:見附錄A。
3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
3.4.1 十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液(5.00mg/mL):準(zhǔn)確稱取2.5g(至0.1mg)十一碳酸甘油三酯
至燒杯中,加入甲醇溶解,移入500mL容量瓶后用甲醇定容,在冰箱中冷藏可保存1個月。
3.4.2 混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液:取出適量脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)移至到10mL容量瓶中,用正庚烷稀
釋定容,貯存于-10℃以下冰箱,有效期3個月。
3.4.3 單個脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液:將單個脂肪酸甲酯分別從安瓿瓶中取出轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中,用
正庚烷沖洗安瓿瓶,再用正庚烷定容,分別得到不同脂肪酸甲酯的單標(biāo)溶液,貯存于-10 ℃以下冰箱,
有效期3個月。
4 儀器設(shè)備
4.1 勻漿機或?qū)嶒炇矣媒M織粉碎機或研磨機。
4.2 氣相色譜儀:具有氫火焰離子檢測器(FID)。
4.3 毛細(xì)管色譜柱:聚二氰丙基硅氧烷強極性固定相,柱長100m,內(nèi)徑0.25mm,膜厚0.2μm。
4.4 恒溫水浴:控溫范圍40℃~100℃,控溫±1℃。
4.5 分析天平:感量0.1mg。
4.6 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
5 分析步驟
5.1 試樣的制備
在采樣和制備過程中,應(yīng)避免試樣污染。固體或半固體試樣使用組織粉碎機或研磨機粉碎,液體試
樣用勻漿機打成勻漿于-18℃以下冷凍保存,分析用時將其解凍后使用。
5.2 試樣前處理
5.2.1 水解-提取法
5.2.1.1 試樣的稱取
稱取均勻試樣0.1g~10g(至0.1mg,約含脂肪100mg~200mg)移入到250mL平底燒瓶中,準(zhǔn)確加入2.0mL十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液。加入約100mg焦性沒食子酸,加入幾粒沸石,再加入2mL95%乙醇和4mL水,混勻。根據(jù)試樣的類別選取相應(yīng)的水解方法,乳制品采用堿水解法;乳酪采用酸堿水解法;動植物油脂直接進行步驟5.2.1.4;其余食品采用酸水解法。
注:根據(jù)實際工作需要選擇內(nèi)標(biāo),對于組分不確定的試樣,次檢測時不應(yīng)加內(nèi)標(biāo)物。觀察在內(nèi)標(biāo)物峰位置處是否有干擾峰出現(xiàn),如果存在,可依次選擇十三碳酸甘油三酯或十九碳酸甘油三酯或二十三碳酸甘油三酯作為內(nèi)標(biāo)。
5.2.1.2 試樣的水解
酸水解法:食品(除乳制品和乳酪):加入鹽酸溶液10mL,混勻。將燒瓶放入70 ℃~80 ℃水浴中
水解40min。每隔10min振蕩一下燒瓶,使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后,取出
燒瓶冷卻至室溫。
堿水解法:乳制品(乳粉及液態(tài)乳等試樣):加入氨水5mL,混勻。將燒瓶放入70℃~80℃水浴中水解20min。每5min振蕩一下燒瓶,使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后,取出燒瓶冷卻至室溫。
酸堿水解法:乳酪:加入氨水5mL,混勻。將燒瓶放入70 ℃~80 ℃水浴中水解20min。每隔10min振蕩一下燒瓶,使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。接著加入鹽酸10 mL,繼續(xù)水解20min,每10min振蕩一下燒瓶,使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后,取出燒瓶冷卻至室溫。
5.2.1.3 脂肪提取
水解后的試樣,加入10mL95%乙醇,混勻。將燒瓶中的水解液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,用50mLy醚石油醚混合液沖洗燒瓶和塞子,沖洗液并入分液漏斗中,加蓋。振搖5min,靜置10min。將醚層提取液收集到250mL燒瓶中。按照以上步驟重復(fù)提取水解液3次,后用y醚石油醚混合液沖洗分液漏斗,并收集到250mL燒瓶中。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干,殘留物為脂肪提取物。
5.2.1.4 脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化
在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8mL,連接回流冷凝器,80℃±1℃水浴上回流,直至油滴消失。從回流冷凝器上端加入7mL15%三f化硼甲醇溶液,在80 ℃±1 ℃水浴中繼續(xù)回流2min。用少量水沖洗回流冷凝器。停止加熱,從水浴上取下燒瓶,迅速冷卻至室溫。準(zhǔn)確加入10mL~30mL正庚烷,振搖2min,再加入飽和氯化鈉水溶液,靜置分層。吸取上層正庚烷提取溶液大約5mL,至25mL試管中,加入大約3g~5g無水硫酸鈉,振搖1min,靜置5min,吸取上層溶液到進樣瓶中待測定。
5.2.2 酯交換法
適用于游離脂肪酸含量不大于2%的油脂樣品。
5.2.2.1 試樣稱取
稱取試樣60.0mg至具塞試管中,至0.1mg,準(zhǔn)確加入2.0mL內(nèi)標(biāo)溶液。
5.2.2.2 甲酯制備
加入4mL異辛烷溶解試樣,必要時可以微熱使試樣溶解后加入200μL氫氧化鉀甲醇溶液,蓋上玻璃塞猛烈振搖30s后靜置至澄清。加入約1g硫酸氫鈉,猛烈振搖,中和氫氧化鉀。待鹽沉淀后,將上層溶液移至上機瓶中,待測。
5.3 測定
5.3.1 色譜參考條件
取單個脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液和脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入氣相色譜儀,對色譜峰進行定性。
脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液氣相色譜圖,見附錄B。
a) 毛細(xì)管色譜柱:聚二氰丙基硅氧烷強極性固定相,柱長100m,內(nèi)徑0.25mm,膜厚0.2μm。

b) 進樣器溫度:270℃。
c) 檢測器溫度:280℃。
d) 程序升溫:初始溫度100℃,持續(xù)13min;
100℃~180℃,升溫速率10℃/min,保持6min;
180℃~200℃,升溫速率1℃/min,保持20min;
200℃~230℃,升溫速率4℃/min,保持10.5min。
e) 載氣:氮氣。
f) 分流比:100∶1。
g) 進樣體積:1.0μL。
h) 檢測條件應(yīng)滿足理論塔板數(shù)(n)至少2000/m,分離度(R)至少1.25。
5.3.2 試樣測定
5.3.2.1 試樣溶液的測定
在上述色譜條件下將脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)測定液及試樣測定液分別注入氣相色譜儀,以色譜峰峰面積定量。